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[[Datei:Airydisks rayleigh sqrt.png|miniatur|Raleigh-Kriterium: zwei Beugungsscheibchen, die sich gerade noch unterscheiden lassen]]

Unter '''Auflösung''' versteht man in der [[Mikroskopie]] den Abstand, den zwei Strukturen mindestens haben müssen, um noch als getrennte Strukturen wahrgenommen werden zu können. Dabei wird beispielsweise der zur getrennten Erkennung nötige minimale Abstand zweier punktförmiger Objekte oder der minimale Abstand zwischen Linien in einem [[Optisches Gitter|optischen Gitter]] betrachtet.

Die erreichbare Auflösung ist in der klassischen Lichtmikroskopie fundamental durch [[Beugung (Physik)|Beugung]] begrenzt. Diese Grenze wird als '''Auflösungsgrenze''' oder '''Abbe-Limit''' bezeichnet, nach [[Ernst Abbe]], der diese Beziehung im 19. Jahrhundert beschrieb. Neuere methodische Ansätze erlauben auch eine Auflösung jenseits dieser Grenze.

Um die theoretisch mögliche Auflösung zu ermöglichen, ist es erforderlich, dass genügend Licht gesammelt wird. Bei [[Hellfeldmikroskopie]] ist dies in der Regel unproblematisch. Bei der [[Fluoreszenzmikroskopie]] können niedrige Intensitäten in Verbindung mit kurzen Belichtungszeiten jedoch dazu führen, dass zu wenige Photonen am Detektor auftreffen und der erreichte [[Kontrast]] zur getrennten Erkennung der Strukturen nicht ausreicht.

Von der Auflösung zu unterscheiden ist die Nachweisbarkeit und die erreichbare Positionierungsgenauigkeit. Mit [[Dunkelfeldmikroskopie]], besonders der [[Ultramikroskopie]], oder der Fluoreszenzmikroskopie lassen sich noch Partikel nachweisen, deren Größe erheblich unter der Auflösungsgrenze liegt, bei Fluoreszenzmikroskopie bis hinunter zu einzelnen Farbstoffmolekülen. Bei der Positionierungsgenauigkeit geht es darum, die Position einer Oberfläche oder eines Körpers möglichst genau im Raum zu bestimmen. Dazu kann das Helligkeitsmaximum des von einem Körper ausgehenden Lichts bestimmt werden. Dies ist mit einer Genauigkeit im Nanometerbereich möglich. In beiden Fällen unterschreitet die Auflösung jedoch nicht die Auflösungsgrenze: Es ist beispielsweise nicht möglich festzustellen, ob ausgesandtes Licht tatsächlich von einer punktartigen Struktur stammt oder von mehreren nahe beieinander liegenden.

== Rayleigh-Kriterium und Halbwertsbreite ==
[[Datei:FWHMofAiryDisk.png|thumb|Idealisierte Helligkeitsverteilung durch das Beugungsscheibchen eines punktförmigen fluoreszierenden Objektes (rot) mit eingezeichneter Halbwertsbreite (blau)]]

Das [[Rayleigh-Kriterium]] besagt, dass sich zwei Punkte dann gerade noch unterscheiden lassen, wenn das Maximum des Beugungsscheibchens des ersten Punktes in das Minimum des Beugungsscheibchens des zweiten Punktes fällt (siehe Abbildung). Die Helligkeit der dunkelsten Stelle zwischen den beiden Maxima beträgt dann 73,5 % der Maxima.<ref name=CoxCh5>{{bibISBN|9780849339196|Seite=57–75}}</ref>

Die Auflösung nach dem Rayleigh-Kriterium lässt sich zwar berechnen, aber experimentell nur schwer bestimmen: Zwei sehr kleine Objekte müssen immer näher zusammen geschoben werden, bis sie nicht mehr unterscheidbar wären. Aus praktischen Gründen behilft man sich in der Fluoreszenzmikroskopie daher mit der [[Halbwertsbreite]] (engl.: {{lang|en|''full width half maximum''}}, FWHM) der [[Punktspreizfunktion]] (engl. {{lang|en|''point spread function''}}, PSF). Die Punktspreizfunktion beschreibt das durch Beugung zu Stande kommende dreidimensionale Abbild eines fluoreszenten Punktes, sie ist eine Funktion des optischen Systems, im Wesentlichen des Objektivs. Sie kann ebenfalls berechnet werden<ref>{{cite journal |author= M. J. Nasse, J. C. Woehl|title=Realistic modeling of the illumination point spread function in confocal scanning optical microscopy |journal=J. Opt. Soc. Am. A |volume=27 |issue=2 |pages=295–302 |year=2010 |doi=10.1364/JOSAA.27.000295}}</ref>.
Für die experimentelle Bestimmung werden fluoreszierende Objekte eingesetzt, deren Größe unter der Auflösungsgrenze liegt, beispielsweise 150 Nanometer kleine, mit Fluoreszenzfarbstoff getränkte Latexkügelchen oder [[Quantenpunkt]]e. Gemessen wird die Halbwertsbreite der Intensitätskurve in Nanometern oder Mikrometern (siehe Abbildung). Auflösung und Halbwertsbreite der PSF stehen in einer mathematischen Beziehung zu einander, die PSF-Halbwertsbreite liegt bei etwas kleineren Werten als die Auflösung<ref name="oly">{{cite web |url=http://www.olympusfluoview.com/theory/resolutionintro.html |title=Theory of Confocal Microscopy - Resolution and Contrast in Confocal Microscopy |author=Kenneth R. Spring, Thomas J. Fellers, Michael W. Davidson |accessdate=25. April 2010}}</ref>.

== Auflösung in der klassischen Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie ==
=== Auflösung in der Fokusebene (x,y) ===
Die Auflösung (Rayleigh-Kriterium) in der Fokusebene beträgt <math>d=\frac{0{,}61\lambda}{\mathrm{NA}}</math>, die Halbwertsbreite der PSF liegt bei <math>\frac{0{,}51\lambda}{\mathrm{NA}}</math>, wobei NA die [[numerische Apertur]] des verwendeten Objektivs ist und λ die Wellenlänge des emittierten Lichtes.<ref name=Amos>B. Amos, G. McConnell, T. Wilson: '' Confocal microscopy''. In: E. Egelman (ed.): ''Comprehensive Biophysics''. Elsevier, Amsterdam 2012.</ref>

=== Auflösung entlang der optischen Achse (z-Richtung) ===
Die Auflösung eines Mikroskops ist entlang der optischen Achse generell schlechter als innerhalb der Fokusebene. In konventionellen Mikroskopen liegt sie bei
:<math>d=\frac{0{,}51\lambda}{n-\sqrt{n^2-\mathrm{NA}^2}}</math>
wobei <math>n</math> der [[Brechungsindex]] des Mediums zwischen Objektiv und Deckglas oder Präparat ist, also zum Beispiel 1 für Luft bei Trockenobjektiven oder 1,518 für typisches [[Immersion (Mikroskopie)|Immersionsöl]]. Die Halbwertsbreite der PSF liegt bei
:<math>\frac{0{,}88\lambda}{n-\sqrt{n^2-\mathrm{NA}^2}}</math>.<ref name=Amos/>

== Konfokalmikroskopie ==
=== Auflösung in der Fokusebene (x, y) ===
Bei der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie wird die Probe großflächig beleuchtet und durch das Objektiv abgebildet, so dass die PSF des Gesamtsystems nur durch die (Detektions-)PSF des Objektivs bestimmt ist. Im Gegensatz dazu wird die Probe im konfokalen Mikroskop mit dem Beugungsscheibchen (genauer: der Punktspreizfunktion) der Beleuchtungslochblende beleuchtet. In diesem Fall wird die Auflösung des Gesamtsystems also durch die Multiplikation zweier Punktspreizfunktionen bestimmt, nämlich der Beleuchtungs-PSF und der Detektions-PSF. Durch diese Multiplikation ändert sich der Durchmesser des Beugungsscheibchens nicht, das erste Minimum ist noch an der gleichen Stelle wie zuvor. Allerdings ist der Helligkeitsanstieg nun steiler, die Flanken der Helligkeitsverteilung rücken nach innen. Zwei solcher multiplizierten Beugungsscheibchen liegen daher dichter beieinander, wenn die minimale Intensität zwischen den Maxima die im vorigen Abschnitt erwähnten 73,5 % erreicht, das verallgemeinerte Rayleigh-Kriterium<ref name=royal>{{bibISBN|1872748724|Seite=37, 39–42}}</ref>. Theoretisch ergibt sich dadurch eine Verbesserung der Auflösung um den Faktor <math>1/\sqrt{2}</math>, also etwa <math>1/1{,}4</math>.<ref name=CoxCh5/><ref name=coxsheppard>G. Cox, C. J. Sheppard: ''Practical limits of resolution in confocal and non-linear microscopy.'' In: ''Microscopy research and technique.'' Band 63, Nummer 1, 2004, S.&nbsp;18–22, {{ISSN|1059-910X}}. {{DOI|10.1002/jemt.10423}}, PMID 14677129.</ref>

In der Fokusebene ergäbe sich für die Halbwertsbreite des Signals eines fluoreszierenden punktförmigen Objekts
<math>\frac{0{,}51\lambda}{\sqrt{2} \cdot \mathrm{NA}}</math> oder <math>\frac{0{,}37\lambda}{\mathrm{NA}}</math>, wobei bei Fluoreszenz als Wellenlänge der Mittelwert von Anregungs- und Emissionswellenlänge einzusetzen ist. Bei grünem Licht (Wellenlänge 500&nbsp;nm) entspricht dies bei einem Ölimmersionsobjektiv mit 1,4 numerischer Apertur einer Halbwertsbreite von 132&nbsp;nm (nicht-konfokal: 182&nbsp;nm).
Jedoch kann dieser Wert nur theoretisch, bei unendlich kleiner Lochblende erreicht werden, bei der also kein Licht mehr aufgefangen werden würde. Auch wird vorausgesetzt, dass das anregende Licht das Objektiv von der Rückseite her vollständig ausfüllt. Dies ist jedoch nicht immer der Fall.<ref name=coxsheppard/><ref name=Amos/>

Die praktisch erzielbare Verbesserung ist daher geringer. Sie hängt davon ab, wieviel des Beugungsscheibchens von der Lochblendenöffnung durchgelassen wird, also vom Durchmesser der Lochblende. Liegt der Lochblendendurchmesser im ersten Minimum des Beugungsscheibchens, so ist die Auflösung in der Fokusebene nicht mehr besser als im nicht-konfokalen Fall, wogegen die Signalintensität dann schon fast maximal ist. Der Ausschluss von Fluoreszenz aus anderen Ebenen funktioniert jedoch noch recht gut.<ref name=royal>{{bibISBN|1872748724|Seite=37, 39-42}}</ref> Daher ist dieser Wert bei kommerziellen Konfokalmikroskopen häufig voreingestellt. Er wird als eine {{lang|en|''Airy unit''}} (AU) bezeichnet, nach den englischen Begriffen {{lang|en|''Airy disk''}} (=&nbsp;Beugungsscheibchen) und {{lang|en|''unit''}} (=&nbsp;Maßeinheit).

=== Auflösung entlang der optischen Achse ===
Auch hier gibt sich wie in der Fokusebene theoretisch eine Verbesserung um den Faktor <math>1/\sqrt{2}</math>, also
:<math>d=\frac{0{,}64\lambda}{n-\sqrt{n^2-\mathrm{NA}^2}}</math> beziehungsweise für die Halbwertsbreite der PSF <math>\frac{0{,}64\lambda}{n-\sqrt{n^2-\mathrm{NA}^2}}</math>

Diese Formeln gelten für fluoreszierende Punktobjekte, die Wellenlänge ist der Mittelwert von Anregungslicht und Fluoreszenzlicht.
Eine dünne fluoreszierende Schicht hat für die Halbwertsbreite eine ähnliche, aber etwas andere Gleichung:
:<math>\frac{0{,}67\lambda}{n-\sqrt{n^2-\mathrm{NA}^2}}</math>.<ref name=Amos/>

Es ergeben sich für diese theoretische Auflösungsverbesserung die gleichen praktischen Einschränkungen, die im vorigen Abschnitt schon für die Auflösungsverbesserung in der Fokusebene beschrieben wurden.<ref name=Amos/>

== Einzelnachweise ==
<references />

[[Kategorie:LichtmikroskEin '''Konfokalmikroskop''' (oder '''CLSM''' für ''confocal laser scanning microscope'') ist eine Variante des [[Lichtmikroskop]]es, das optische Schnitte mit mikroskopischer Auflösung in räumlich ausgedehnten Objekten erzeugen kann. Mit einem Computer können diese Schnittbilder schichtweise zu einer räumlichen Darstellung zusammengesetzt werden.

In einerm "normalen" Lichtmikroskop ist das Bild eine Überlagerung aus einer scharfen Abbildung der Punkte in der Objektebene und einer unscharfen Abbildung der Punkte außerhalb. In einem Konfokalmikroskop dagegen wird das Licht von außerhalb der Objektebene mit einer Lochblende unterdrückt.  

Die meisten - aber keinesfalls alle - Konfokalmikroskope sind [[Laser]]-Scanning-Mikroskope. Bei diesen wird ein Laser-Brennfleck sehr schnell zeilenweise in einer Objektebene bewegt. Das Licht aus dem Brennfleck wird auf eine kleine Lochblende (Pinhole) abgebildet, hinter der sich ein lichtempfindlicher Empfänger befindet. Aus dem Empfängersignal wird dann zeilenweise im Computer
ein (Schnitt-)Bild zusammengesetzt.

Das aus dem Brennfleck zurückkommende Licht kann vom Objekt reflektiertes oder dort erzeugtes [[Fluoreszenz]]licht sein.

Typische Laser-Scanning-Mikroskope sind komplexe Systeme, die
aus folgenden Komponenten bestehen:
* einem klassischen Mikroskop-Stativ
* einem sogenannten Scan-Kopf
* Ansteuerelektronik und -optik für diesen Scankopf
* Computer zur Steuerung der Hardware, Signalerfassung, -auswertung, -darstellung und -archivierung

[[Kategorie:Optik]]

[[en:Confocal laser scanning microscopy]]
[[fr:Microscope confocal à balayage laser]]
[[nl:Fluorescentiemicroscopie]]